鱼油因富含二十碳五烯酸(eicosapentaenoicacid，epa)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid，dha)等n-3多不饱和脂肪酸而具有众多优良的生理活性，目前在医药和保健品领域受到了高度关注。生产鱼油的原料主要是鱼类及其加工副产物，其脂肪含量在1.4～40.1％之间，脂肪含量的高低主要取决于鱼的种类和部位。在大部分鱼类中，脂肪主要沉积在皮肤下以及肌肉，头部和内脏中。因此，新鲜鱼类或其加工副产物是生产高品质鱼油的良好生物资源。
目前生产富含n-3pufas的高品质鱼油，不仅需要优质的新鲜原料，还需要合适的提取方法，传统的鱼油提取方法有压榨法、蒸煮法、溶剂法等。压榨法的鱼油提取率较低，蒸煮法使用高温而使鱼油易氧化变质，溶剂法在工业化生产中易造成鱼油中有溶剂残留。因此，近10多年来，很多研究者开始研究一些新的鱼油提取方法，如酶解法、超临界流体萃取法、超声波辅助提取法等，其中酶解法提取鱼油是利用蛋白酶降解鱼类加工副产物中的蛋白质，使鱼油从副产物中释放出来，再通过离心的方法实现油水分离。这种方法已经广泛用于在生产水解蛋白的同时回收鱼油，然而鱼油的提取率却相对偏低。
专利cn108117922a公开了一种基于高压脉冲电场的鱼油提取工艺，对金枪鱼下脚料所制备的浆状物进行一次酶解、高压脉冲电场处理、二次酶解，并且在一次酶解和二次酶解的过程中同时采用超声波处理，但是该方法处理步骤冗杂，一次酶解9h，通co2气体1h，一次酶解液静置0.5～1h，二次酶解3h，，二次酶解液静置20h，离心0.5h，提取过程持续至少34h，时间成本高，前后使用了胃蛋白酶、超声波处理、co2气体、高压脉冲电场、胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、盐酸、无水乙醇和活性炭，提取鱼油的经济成本大大增加，提取过程中还利用了盐酸调节溶液ph，一定程度上会导致鱼油品质下降。该方法的鱼油提取率为92％，但在酶解液中至少存在有8％的鱼油，这会在一定程度上影响下脚料中其他成分的应用。且利用该方法提取鱼油过程中，会先后产生co2、乙醇、盐酸、活性炭等废弃物，会对环境造成污染。
因此，找到一种简单低成本，提取率高且品质高的鱼油提取方法，对于提高鱼类或加工副产物附加值和减少环境污染具有重要的现实意义。
技术实现要素：
本发明旨在提供一种适合鱼油的提取方法，本发明通过超高压处理结合酶解法从新鲜鱼类或其加工副产物中提取鱼油，优化超高压处理和酶解法提取鱼油的工艺，提取方法简单快捷，鱼油提取率高，最终鱼油提取率达到了99％，几乎不会对下脚料中其他成分的应用造成影响。且本发明提供的方法提取得到的鱼油的理化性质达到了中国水产行业标准sc/t3502-2016一级粗鱼油的标准，为提取高品质鱼油提供了一种优良的途径，同时提高了鱼类或其加工副产物的附加值，避免了鱼类加工副产物直接丢弃而造成的环境污染。
因此，本发明的第一个目的是提供一种鱼油的提取方法。
本发明的另一目的是提供根据上述方法从新鲜鱼类或其加工副产物中提取鱼油的应用。
为实现上述目的，本发明是通过以下方案实现的：
本发明提供了一种鱼油的提取方法，具体包括以下步骤：
s1.用水将新鲜鱼类或其加工副产物清洗干净，切割成小块，绞碎得到碎骨肉；
s2.取步骤s1得到的碎骨肉抽真空封装，进行超高压处理；
s3.向步骤s2超高压处理得到的碎骨肉中加入水和蛋白酶进行酶解反应；
s4.对酶解产物离心，分离上层油相即得所述鱼油。
优选地，所述鱼为海洋鱼类。
最优选地，所述鱼为金枪鱼。
优选地，步骤s2所述超高压处理为置于超高压反应釜中进行处理。
优选地，步骤s2所述高压处理的的压力为100～400mpa，时间为5～30min。
最优选地，步骤s2所述超高压处理的的压力为200mpa，时间为10min。
优选地，步骤s3所述超高压处理的次数为1～3次。
最优选地，步骤s3所述超高压处理的次数为1次。
优选地，步骤s3所述碎骨肉和水的用量比为1:1～3。
最优选地，步骤s3所述碎骨肉和水的用量比为1:1。
优选地，步骤s3所述蛋白酶为木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶中的一种。
最优选地，步骤s3所述蛋白酶为木瓜蛋白酶。由于木瓜蛋白酶最适ph为6～7，因此整个过程中不需要调节酶解液ph，避免造成鱼油品质的下降。
优选地，步骤s3所述蛋白酶的用量为碎骨肉重量的0.5～1.5％。
最优选地，步骤s3所述蛋白酶的用量为碎骨肉重量的1％。
优选地，步骤s3所述酶解反应时间为60～180min。
优选地，步骤s3所述酶解反应温度为45～65℃。
更优选地，步骤s3所述酶解反应温度为45～55℃。
最优选地，步骤s3所述酶解反应为在55℃搅拌酶解60min。
优选地，步骤s4所述离心为在8000～10000r/min下离心10～30min。
最优选地，步骤s4所述离心为在10000r/min下离心20min。
本发明还请求保护通过上述提取方法从新鲜鱼或鱼类加工副产物中提取鱼油的应用，通过本发明的方法从新鲜鱼或鱼类加工副产物中提取鱼油，提取方法简单快捷，鱼油提取率高。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明通过超高压处理结合酶解法从新鲜鱼或鱼类加工副产物中提取鱼油，优化超高压处理和酶解法提取鱼油的工艺，提取方法简单快捷，最终鱼油提取率达到了99％，几乎不会对下脚料中其他成分的应用造成影响。且本发明提供的方法提取得到的鱼油的理化性质达到了中国水产行业标准sc/t3502-2016一级粗鱼油的标准，为提取高品质鱼油提供了一种优良的途径，同时提高了鱼类及其加工副产物的附加值，避免了鱼类加工副产物直接丢弃而造成的环境污染。
附图说明
图1为提取方法对鱼油提取率的影响；
图2为蛋白酶种类对鱼油提取率的影响；
图3为超高压处理的压力与时间之间的交互作用图；
图4为加酶量和酶解时间的交互作用图；
图5为鱼油的气相色谱图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
1、实验材料和仪器
(1)实验材料
聚乙烯(polyethylene,pe)/聚酰胺(polymide,pa)复合包装袋，购于雄县旭日纸塑包装有限公司。中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶，购于南宁庞博生物工程有限公司，酶活均为10万u/g。氢氧化钾、甲醇、正己烷、三氯甲烷、冰乙酸、硫代硫酸钠、无水硫酸钠等试剂均为分析纯。脂肪酸甲酯标准品，购于sigma试剂公司。
(2)试验仪器
dtt-a1000型电子天平(福州华志科学仪器有限公司)；400y多功能粉碎机(永康市铂欧五金制品有限公司)；df-101s-2l型集热恒温磁力搅拌器(上海羌强仪器设备有限公司)；tracegcultra型气相色谱仪(美国热电)；hpp.l2-600/0.6型超高压设备(天津市华泰森淼生物工程技术有限公司)；dw-86l338j型超低温冰箱(青岛海尔特种电器有限公司)；kg33na2l0c型4℃冰箱(博西华家用电器有限公司)；tgl16m型台式高速冷冻离心机(长沙英泰仪器有限公司)；dz400/2d真空包装机(瑞丽包装机械有限公司)。
2、鱼油理化性质和脂肪酸的测定
(1)鱼油理化性质的测定
感官评价：外观和气味，参考sc/t3502-2016；水分及挥发物的测定：参考gb5009.236-2016；酸值测定：参考gb/t35252-2017；过氧化值测定：参考gb5009.227-2016；茴香胺值测定：参考gb/t24304-2009；碘值测定：参考gb/t5532-2008；不溶性杂质测定：参考gb/t15688-2008；不皂化物测定：参考gb/t5535-2008。
(2)鱼油脂肪酸组成的测定
样品甲酯化：将0.5g鱼油放入25ml具塞试管中，加入5ml0.5mol/l氢氧化钾-甲醇溶液。在50±1℃水浴锅中恒温震荡30min，直至油滴消失。取出冷却后，加入5ml正己烷，摇匀后静置2min。取出上清液，加入适量的无水硫酸钠，贮存于样品瓶中，供气相色谱分析。
气相分析条件：色谱柱：db-23气相毛细管柱(上海安谱实验科技股份有限公司)，30m×0.25mm(内径)×0.25um(膜厚)；检测器fid；进样口温度250℃，检测器温度250℃；色谱柱升温程序：50℃保留1min，然后以25℃/min升至165℃，再以1℃/min升至190℃，保留5min，再以5℃/min升至230℃，直至分析完成；载气为氮气，压力30kpa，空气压力350kpa，氢气压力50kpa，分流方式进样，分流比为50:1，进样量为1ul。以面积归一化法定量，采用标准品对照法定性。
3、数据处理
每个试验重复3次，数据用平均值±标准差表示。采用jmp10.0统计软件进行单因素和双因素方差分析以及tukeyhsd多重比较。
实施例1不同的提取方法从金枪鱼中提取鱼油
1、制备方法
(1)酶解提取金枪鱼鱼油
用清水将新鲜的金枪鱼鱼头清洗干净，用电锯将金枪鱼鱼头切割成小块，用粉碎机将其绞碎，称取金枪鱼鱼头碎骨肉50g置于烧杯中，以碎骨肉的质量为基准，按照质量比1：1加入水混合均匀，再按照1％的质量分数加入木瓜蛋白酶，然后在55℃下搅拌酶解120min。酶解结束后，酶解产物在10000r/min条件下离心20min，分离上层油相即为粗鱼油。该方法记为a。
(2)超高压提取金枪鱼鱼油
用清水将新鲜的金枪鱼鱼头清洗干净，用电锯将金枪鱼鱼头切割成小块，用粉碎机将其绞碎，称取金枪鱼鱼头碎骨肉50g置于包装袋内，以碎骨肉的质量为基准，按照质量比1：1加入水，混合均匀，抽真空密封后将其置于超高压处理釜中在300mpa下处理120min(处理釜温度为25±2℃)。处理结束后，用水清洗包装袋和碎骨肉，然后在10000r/min条件下离心20min，分离上层油相即为粗鱼油。该方法记为b。
(3)超高压辅助酶解提取金枪鱼鱼油
用清水将新鲜的金枪鱼鱼头清洗干净，用电锯将金枪鱼鱼头切割成小块，用粉碎机将其绞碎，称取金枪鱼鱼头碎骨肉50g置于包装袋内，以碎骨肉的质量为基准，按照质量比1：1加入水和1％的木瓜蛋白酶，混合均匀，抽真空密封后将其置于超高压处理釜中在300mpa下处理120min(处理釜温度为25±2℃)。处理结束后，酶解产物在10000r/min条件下离心20min，分离上层油相即为粗鱼油。该方法记为c。
(4)超高压结合酶解提取金枪鱼鱼油
用清水将新鲜的金枪鱼鱼头清洗干净，用电锯将金枪鱼鱼头切割成小块，用粉碎机将其绞碎，称取金枪鱼鱼头的碎骨肉50g，抽真空封装于复合包装袋中，置于超高压处理釜中，在300mpa下处理10min，然后卸压取出样品放入烧杯中；以碎骨肉的质量为基准，按照质量比1：1加入水，再加入1％木瓜蛋白质酶，55℃下搅拌酶解120min。酶解结束后，酶解产物在10000r/min条件下离心20min，分离上层油相即为粗鱼油。该方法记为d。
(5)超高压多次处理结合酶解提取金枪鱼鱼油
参照(4)的方法，不同在于超高压三次处理后再进行酶解，该方法记为e。
2、结果分析
图1为不同提取方法对鱼油提取率的影响，从图1可以看出，提取方法对鱼油提取率有显著影响(p<0.05)，鱼油提取率从高到底的顺序依次为d>a>e>c>b，其中a与e之间无显著差异(p>0.05)。超高压提取法的鱼油提取率最低，仅有17.32±1.63％，这是因为超高压虽然能在一定程度上破坏生物组织，造成蛋白质变性，但并不能使蛋白质分子降解，脂类物质的释放仍然受到较大地限制。超高压辅助酶解提取鱼油，可以显著提高鱼油提取率(p<0.05)，这是因为超高压在破坏生物组织和蛋白质分子变性的基础上，蛋白酶对蛋白质又进行了降解，有利于脂类物质的释放；但是超高压辅助酶解的鱼油提取率显著低于单纯酶解的(p<0.05)，这可能是因为超高压虽然能够破坏生物组织，但是超高压也会使蛋白酶变性降低其活性，从而使蛋白酶对蛋白质的降解程度降低，使脂类物质的释放减少。超高压一次处理结合酶解的鱼油提取率显著高于单纯酶解的和超高压辅助酶解的(p<0.05)，这是充分利用了超高压既能破坏生物组织又能使蛋白质适度变性的优势，酶分子更容易与蛋白质接触而使其降解，从而更有利于脂类物质的释放。超高压三次处理结合酶解的鱼油提取率又显著下降了(p<0.05)，这可能是因为超高压多次处理后，生物组织可能被压得致密，不利于蛋白酶的作用。因此，超高压一次处理结合酶解法更适合于鱼油的提取。实施例2蛋白酶种类对金枪鱼鱼油提取率的影响
1、制备方法
同实施例1中(4)超高压结合酶解提取金枪鱼鱼油的方法，分析木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶对超高压结合酶解提取鱼油效果的影响。酶解温度为各自酶的最适温度，木瓜蛋白酶为55℃、菠萝蛋白酶为55℃、中性蛋白酶50℃和胰蛋白酶45℃。
2、结果分析
不同蛋白酶种类对鱼油提取率的影响结果如图2所示，从图2可以看出，蛋白酶种类对鱼油提取率有显著影响(p<0.05)，这可能与蛋白酶的作用条件、酶切位点、金枪鱼鱼头中蛋白质的组成和氨基酸序列等因素有关。利用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶对金枪鱼鱼头碎骨肉进行酶解，鱼油提取率均达到了比较高的水平，而且两者之间无显著差异(p>0.05)；但是从经济的角度考虑，胰蛋白酶的价格远高于木瓜蛋白酶的。因此，选择木瓜蛋白酶用于提取鱼油是比较合适的。实施例3超高压处理条件对金枪鱼鱼油提取率的影响
采用双因素等重复试验设计优化超高压处理条件，试验方案与结果见表1。对表1中的数据进行方差分析，结果见表2，多重比较的结果标注在表1的数据右上角。
表1超高压处理对鱼油提取率的影响(％)
注：表中数据标注有相同字母表示无显著差异(p>0.05)。
表2方差分析
注：p<0.05表示影响显著。
从表2可以看出，超高压处理压力和时间以及两者之间的交互作用对鱼油提取率都有显著影响(p<0.05)。利用jmp数据处理软件的刻画器功能对超高压处理压力和时间之间的交互作用进行分析，结果见图3。从图3可以看出，当超高压处理时间为5min时，压力为100、200、300mpa时，鱼油提取率是增加的，压力达到400mpa时，鱼油提取率下降；当超高压处理时间为10min时，压力在100和200mpa时，鱼油提取率是增加的，压力达到300mpa和400mpa时，鱼油提取率下降；当超高压处理时间为20min和30min时，随着压力增加，鱼油提取率持续下降。当超高压处理压力为100～400mpa时，随着处理时间的延长，鱼油的提取率都呈现出先增加而后下降的趋势，但是在不同的处理压力下，鱼油提取率出现的峰值不同。出现这种现象的原因主要是超高压处理压力与时间之间存在交互作用。这与蛋白质在超高压条件下的变性程度密切相关，蛋白质的变性程度又与其蛋白酶酶切位点的暴露密切相关。在合适的超高压条件下处理，使蛋白质的变性程度达到其酶切位点暴露最多的时候，酶解的效率达到最高，从而有利于脂类物质的充分释放，提高鱼油提取率。
从图3还可以看出，当超高压处理压力为200mpa和处理时间10min时，或者处理压力为100mpa和处理时间20min时，鱼油提取率均接近于100％。从节省时间的角度出发，选择超高压处理压力200mpa和处理时间10min是比较合适的。
实施例4酶解条件对金枪鱼鱼油提取率的影响
采用双因素等重复试验设计优化加酶量和酶解时间，试验方案与结果见表3。对表3中的数据进行方差分析，结果见表4，多重比较的结果标注在表3的数据右上角。
表3酶解条件对鱼油提取率的影响(％)
注：表中数据标注有相同字母表示无显著差异(p>0.05)。
表4方差分析
注：p<0.05表示影响显著。
从表4可以看出，加酶量和酶解时间以及两者之间的交互作用对鱼油提取率都有显著影响(p<0.05)。利用jmp数据处理软件的刻画器功能对加酶量和酶解时间之间的交互作用进行分析，结果见图4。
从图4可以看出，随着加酶量和酶解时间的增加，鱼油提取率都是增加的，最终都可以达到100％的提取率。但是，当加酶量较低时，需要的酶解时间较长；当加酶量较高时，需要的酶解时间较短。这是加酶量和酶解时间之间的交互作用的结果。通过选择合适的加酶量和酶解时间，鱼油提取率均可以达到了99％，因此在生产中可以根据实际情况选用酶解条件。本研究中为了节省酶解时间，选择酶解条件为加酶量1.0％和酶解时间60min。
实施例5金枪鱼鱼油的理化性质
1、制备方法
用清水将新鲜的金枪鱼鱼头清洗干净，用电锯将金枪鱼鱼头切割成小块，用粉碎机将其绞碎，称取金枪鱼鱼头的碎骨肉50g，抽真空封装于复合包装袋中，置于超高压处理釜中，在200mpa下处理10min，然后卸压取出样品放入烧杯中；以碎骨肉的质量为基准，按照质量比1：1加入水，再加入1％木瓜蛋白质酶，55℃下搅拌酶解60min。酶解结束后，酶解产物在10000r/min条件下离心20min，分离上层油相即为粗鱼油。
2、结果分析
对提取的鱼油进行理化性质分析，并与我国水产行业鱼油的标准进行比较，结果见表5。
表5鱼油的理化性质
注：“—”表示标准中不做限定。
从表5可以看出，超高压结合酶解法提取的鱼油达到了标准粗鱼油的标准。
实施例6金枪鱼鱼油的脂肪酸组成
1、制备方法同实施例5
2、结果分析
利用气相色谱分析鱼油的脂肪酸组成，结果见图5，由图5得到鱼油的脂肪酸组成见表6。
表6鱼油的脂肪酸组成
从表6中可以看出，从金枪鱼鱼油中检测到24种脂肪酸，饱和脂肪酸以棕榈酸(c16:0)、硬脂酸(c18:0)和月桂酸(c14:0)为主，含量为28.29％；单不饱和脂肪酸以油酸(c18:1，n-9)、花生油酸(c20:1，n-9)和棕榈油酸(c16:1，n-7)为主，含量为32.70％；多不饱和脂肪酸以dha(c22:6，n-3)和epa(c20:5，n-3)为主，含量为33.96％。金枪鱼鱼油的不饱和脂肪酸的含量远远高于饱和脂肪酸的，饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸的比例接近于1:1:1，符合who/fao建议的膳食脂肪酸摄入比例。
dha和epa含量的高低是评价鱼油品质和经济价值的重要指标之一。有研究表明：dha对神经系统疾病具有很好的预防和治疗作用，dha还对婴幼儿和青少年的大脑和视力发育具有很好的保健作用，而epa则对心血管系统疾病具有很好的预防和治疗作用。黄鳍金枪鱼鱼油中的dha和epa的总含量为27.92％，而且dha的含量大于epa，dha/epa的比值为3.6。因此，本方法提取的金枪鱼鱼油是一种以dha为主的鱼油，可以用于开发益智健脑、促进视力发育、预防神经系统疾病的保健品。
who/fao建议膳食中n-6与n-3pufas摄入比值应为4～6，而目前我国居民膳食中n-6与n-3pufas摄入比值高达10，说明我国居民膳食中严重缺乏n-3pufas。本方法提取的鱼油的n-6与n-3pufas的比值为0.22，远小于who/fao建议的标准。因此，金枪鱼鱼油是良好的n-3pufas的来源。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围
